Caractérisation d’un ARN de Staphylococcus aureus
Description de quelques manipulations

 

Un laboratoire cherche un ARN spécifique de la bactérie Staphylococcus aureus. Pour cela différentes étapes sont nécessaires :

Partir d’une souche de S. aureus conservée dans la souchothèque. (Stockage cellules dans la CF/autres activités)
- Conservation sur gélose.
- Conservation au froid à -80°C.
- Conservation dans l’azote liquide.

Amplifier la souche d’origine. (Autres activités/labo L2 avec PSM)
- Transporter la souche vers le laboratoire de confinement adapté au risque.
- Ensemencer stérilement un milieu de culture en partant du tube de la souchothèque. (Labo L2 avec PSM)
- Incuber pendant 12 h à 37°C.

Extraire l’ARN de S. aureus.
- Concentrer les bactéries. (Labo L2 avec PSM)
o Centrifuger le milieu de culture liquide.
o Remettre en suspension les bactéries du culot dans un plus petit volume (tube Eppendorf®).

 

- Casser les cellules bactériennes (exemple, parmi d’autres, de la technique FastPrep®). (Labo L1 avec sorbonne)
o Mettre des billes de silice dans un tube Eppendorf® (bouchon à vis).
o Verser la suspension bactérienne dans le tube contenant les billes de silice.
o Agiter fortement le tube dans l’appareil FastPrep®.
o Centrifuger les billes de silice.
o Recueillir le surnageant contenant l’ADN, l’ARN et les protéines des bactéries.

 

 

- Extraire l’ARN. (Labo L1 avec sorbonne)
o Chauffer du phénol à 65°C.
o Verser le broyat bactérien dans le phénol chaud.
o Agiter au Vortex® le tube contenant le broyat et le phénol.
o Centrifuger le tube (les ARN se trouvent dans la phase aqueuse supérieure, alors que l’ADN et les protéines se trouvent dans l’interphase ou la phase inférieure contenant le phénol).
o Prélever la phase aqueuse contenant l’ARN et la verser dans un tube Eppendorf®.
o Ajouter du chloroforme dans le tube.
o Agiter le tube au Vortex®.
o Centrifuger le tube.
o Prélever la phase aqueuse.
o Répéter ces quatre dernières opérations plusieurs fois.

 

 

 

Contrôler la qualité et la quantité d’ARN. (Labo L1 espace BET, Local de pesée et local avec lampe UV)
- Préparer un gel d’agarose pour électrophorèse.
o Peser la poudre d’agarose et la verser dans le tampon de migration.
o Chauffer la solution d’agarose au micro-onde.
o Laisser refroidir l’agarose et ajouter du bromure d’éthidium (BET) (1 μl).
o Couler l’agarose dans le support du gel.
o Oter le peigne formant les puits.
o Verser le tampon de migration dans la cuve d’électrophorèse.

 

 

 

- Réaliser l’électrophorèse.
o Ajouter du colorant de charge dans l’échantillon d’ARN.
o Déposer l’échantillon d’ARN dans les puits du gel.
o Fermer la cuve.
o Brancher le courant et laisser migrer l’ARN.
o Débrancher la cuve et sortir le gel.

 

 

 

- Visualiser la migration de l’ARN.
o Déposer le gel sur une lampe UV et visualiser les bandes d’ARN.

 

 

Rechercher un ARN spécifique. (Pièce de radioactivité / Soute de radioactivité)
- Préparer un gel d’agarose et faire migrer l’échantillon d’ARN comme décrit lors de l’étape précédente.
- Transférer l’ARN du gel vers une feuille de nitrocellulose.

- Radiomarquer la sonde
o Se déplacer dans une salle technique dédiée à la manipulation de sources radioactives.
o Prendre le conteneur de la solution mère de 32P (50µl et activité volumique de 370 MBq/ml)
o Se placer sur le plan de travail dédié à la manipulation de 32P.
o Pipeter 2 µl de 32P dans la solution mère
o Ajouter au tube contenant les éléments nécessaires au marquage de la sonde : la sonde spécifique de l’ARN recherché, les nucléotides, l'ARN polymérase.
o Laisser le marquage se réaliser pendant quelques minutes à 37°C et rincer afin d'éliminer la radioactivité non fixée sur la sonde.

- Hybrider la sonde avec l'ARN recherché
o Placer la feuille de nitrocellulose comportant les ARN dans un tube d’hybridation.
o Verser le tampon d’hybridation dans le tube.
o Ajouter la sonde ARN radiomarquée dans le tube.
o Placer le tube d’hybridation dans un incubateur.
o Après 1 nuit, enlever la feuille de nitrocellulose et la rincer pour éliminer ce qui ne s'est pas hybridé.

- Révéler l'ARN recherché
o Envelopper la feuille dans du film plastique et la placer dans une cassette contenant un écran radioluminescent à mémoire.
o Après 1 à 4 heures, placer l’écran dans un appareil à faisceaux laser, afin de visualiser la bande d’ARN reconnue par la sonde radiomarquée.
o Comparer la position de la bande sur l'écran avec les bandes sur le gel afin d'identifier l'ARN recherché.